Analyse de l'impact du polymorphisme de gènes d'intérêt sur certaines fonctions zootechniques par transgénèse ; validation in vivo de la fonction de gènes.

Les avancées des cartes du génome des espèces d'élevage et de notre compréhension de certaines fonctions physiologiques permettent de suspecter l'importance de certains gènes sur des caractères d'intérêt zootechnique. Cependant, le rôle et l'impact sur un caractère du polymorphisme d'un gène particulier restent souvent hypothétiques, car s'appuyant essentiellement sur des associations statistiques entre le génotype identifié et le phénotype observé. De fait, ces analyses doivent souvent être étayées par la création de modèles. Parmi ceux-ci, la transgénèse chez la Souris tient une place de choix, même si elle n'est pas toujours physiologiquement pertinente, car elle seule permet d'aborder de telles études dans la complexité pluri-tissulaire et pluri-cellulaire d'un organisme vivant. Une telle approche a été mise en place au sein de notre laboratoire dès 1987 et a conduit à la création d'un atelier dédié à cette activité au début des années 1990.

Actuellement, l'étude de la fonction d'un gène est tout d'abord abordée par l'analyse de leur spécificité tissulaire et par la caractérisation des produits de leur expression. D'abord axée sur l'analyse de l'expression et de la régulation de gènes majeurs des protéines du lait (Caséines, Alpha-Lactalbumine notamment). Ce type de travail a d'abord été entrepris dans l'unité, sur les gènes spécifiant les protéines majeures du lait (Caséines, Alpha-Lactalbumine notamment). Il s'est poursuivi par la recherche d'éléments cis-régulateurs au sein de tels loci. Cette approche devrait permettre à terme le développement par transgénèse additive de vecteurs efficients spécifiques de la glande mammaire qui ouvrirait de nouvelles perspectives dans le cadre de la modification de la composition du lait. Elle fait l'objet de collaborations étroites avec le laboratoire de Biologie du Développement et Biotechnologies.

L'activité du groupe s'est étendue à partir de 1996 à la création de modèles pour l'analyse (i) de gènes impliqués dans le développement et/ou la différenciation du tissu épithélial mammaire, (ii) des maladies à prions et (iii), plus récemment encore, de gènes à effet majeur sur des caractères de reproduction.

L'analyse de la fonction de ces gènes a ainsi été abordée par la création de modèles murins qui soit les sur-exprimaient dans tels ou tels types cellulaires soit, au contraire, au sein desquels ce gène a été invalidé par recombinaison homologue dans les cellules ES. D'autres gènes impliqués notamment dans la transduction du signal de la prolactine (protéines SOCS, ..) font maintenant l'objet de telles études, en collaboration soit avec le laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire soit avec le Dr Hennighausen (N.I.H.). Les modèles créés ou en cours d'élaboration vont : (i) de la sur-expression de ces protéines dans certains types cellulaires par utilisation de promoteurs induits (ii) à leur invalidation tissulaire par emploi de recombinaison homologue associé au système Cre/LoxP, (iii) en passant par des essais d'inactivation ciblée par interférence à ARN.

Les phénotypes induits sont/seront analysés par l'approche histologique ainsi que par les techniques de la biologie moléculaire (transcrits et/ou protéines). L'ensemble de ces approches devrait nous permettre une meilleur compréhension de la fonction de ces protéines dans la physiologie de la glande mammaire. Leur simple invalidation dans des cellules ES peut en effet conduire soit à une mort embryonnaire, soit à des phénotypes pour lesquels l'effet propre du génotype dans les cellules épithéliales est difficilement dissociable de celui induit par l'absence de la protéine dans d'autres cellules.

D'autres gènes majeurs seront ainsi analysés au fur et à mesure de leur identification dans le cadre des études de recherche de gènes à effet majeur et de QTL décrites dans les chapitres précédents. Déjà, l'analyse du locus PIS a été initiée en collaboration avec l'équipe BDR (BDB). Des souris porteuses du BAC caprin renfermant ce locus ont été obtenues. D'autres sur-exprimant le gène SRY de Chèvre sont en cours d'obtention afin d'analyser si la cible de PISRT1 ne serait pas le gène SRY.
La vitesse de traite chez la Chèvre, Polled et bulldog chez les Bovins, les gènes de résistance au maladie chez les Ovins et les gènes de coloration ou responsables de maladie chez le Cheval pourraient être initiées dans les prochaines années. L'étude de ces gènes fera appel à des modèles transgéniques pour valider la fonction putative du gène identifié et analyser l'impact potentiel de sa dérégulation.

Certains gènes majeurs font déjà l'objet d'applications dans le développement d'animaux modèles. On citera par exemple les recherches menées en collaboration avec nos collègues virologues (VIM) sur l'obtention de souris hautement sensibles aux agents de la tremblante du Mouton par sur-expression de l'allèle VRQ de la protéine PrP ovine (souris dites rapides). Des recherches analogues sont en cours avec le gène Prnp bovin. Un des objectifs pratiques est de mettre au point un test biologique sensible et relativement rapide de dépistage des agents infectieux de la tremblante du Mouton et/ou de l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Ces souris sont également en cours de validation en tant que modèle d'analyse de la variabilité naturelle existante des souches de tremblante. D'autres applications visent à : (i) préciser le rôle de certains types cellulaires sur la propagation de l'agent infectieux in vivo (promoteurs induits, invalidation restreinte à certains tissus par le système Cre/LoxP, interférence à ARN) ; (ii) utiliser les souris transgéniques pour dériver des lignées cellulaires à même de propager ex-vivo cet agent ; (iii) analyser la corrélation éventuelle entre l'état infecté de l'animal et le transcriptome dans certains tissus (collaboration avec l'UMR 1061). - en savoir plus...

Ces outils d'analyse des agents infectieux des ESST seront affinés par l'emploi des gènes, autres que le gène Prnp, qui influencent la susceptibilité des animaux à ces maladies et qui sont actuellement recherchés dans le cadre d'une approche QTL.

Autres perspectives :

Contrôle de l'expression de gènes in vivo

Les résultats préliminaires encourageants au cours de l'étude du BAC caprin de 160 kb renfermant le locus du gène de l'alpha-lactalbumine (voir), nous inciteraient à poursuivre cette analyse afin de rechercher d'éventuelles séquences isolatrices. Ceci impliquerait (i) la recherche de régions d'hypersensibilité à la DNAse, (ii) l'analyse fonctionnelle des séquences MAR prédites in silico, (iii) le développement des analyses en transfections cellulaires et (iv) soit la mise au point d'une technique efficiente de recombinaison homologue chez E. Coli, soit la recherche de BAC chevauchants couvrants cette région puis l'analyse de l'expression du gène alpha-lactalbumine résultante de leur injection dans des souris. Ce travail lourd, même s'il était mené en étroite collaboration avec l'équipe BDR qui étudie de façon analogue le locus WAP, nécessiterait un plein temps et n'est pas notre priorité actuelle.

Nous cherchons également à développer des vecteurs permettant de réprimer efficacement l'expression d'un gène cible in vivo. En effet, de tels vecteurs seraient utiles pour l'étude du rôle des protéines SOCS dans le développement et la différenciation du tissu mammaire et pour l'inhibition du gène Prnp dans certains tissus de Souris en cours d'incubation. Ils devraient répondre à plusieurs objectifs : (i) l'inactivation d'un gène endogène dans un tissu donné de façon soit transitoire, soit permanente, sans avoir recours à la recombinaison homologue, (ii) l'invalidation simultanée de plusieurs gènes, notamment lorsqu'on étudie des familles multi-géniques ayant des fonctions partiellement redondantes, (iii) la mise au point de vecteurs de thérapie génique. Deux stratégies ont été initiées :

• L'emploi de ribozymes associés à des séquences mobilisatrices d'hélicases. L'adjonction de ces dernières augmenterait significativement l'efficacité des ribozymes Kawasaki H. et al, 2002. Une telle construction dirigée contre l'ARNm du gène SOCS3 a été réalisée, validée in vitro, et est en cours d'étude in vivo.

• L'emploi de l'interférence à ARN par expression de courts ARN double brin ou siRNA. Cette nouvelle méthodologie, très efficiente en culture cellulaire comme nous avons pu l'expérimenter sur notre modèle prion (Mata X. et al, 2003), demeure peu utilisée en transgénèse faute de vecteurs adapaés Shinagawa T. et al, 2003. A partir de nos modèles biologiques (glande mammaire (protéines SOCS et récepteur prolactine) et ESST), nous testons plusieurs approches : (i) l'insertion d'un vecteur à promoteur Pol III dans, ou en association avec, un gène à promoteur Pol II. L'expression de ce dernier conférerait une structure ouverte à la chromatine et dirigerait ainsi indirectement l'activité du promoteur Pol III, (ii) l'emploi de constructions à promoteur Pol II pour exprimer soit de courts ARN en orientation sens et anti-sens, soit un ARN précurseur de micro-ARN Zeng Y. et al, 2002.

Etude de l'allèle ARR ovin

Implication de micro-ARN dans le développement ou la différenciation mammaire

Récemment la découverte de l'expression de micro-ARN, ne codant pas pour des protéines et inhibant la traduction d'ARN messagers cibles dans les cellules animales, a ouvert de nouvelles perspectives pour la compréhension de la régulation du génome. Initialement, ces micro-ARN ont été suspectés ne réguler que le développement embryonnaire Gottesman S. 2002. Des analyses in silico suggérent que près de 250 gènes de ce type seraient en fait présents dans le génome humain Lim L.P. et al, 2003. Chez la Drosophile, il a récemment été démontré que le gène bantam code pour un micro-ARN qui régule une grande fonction physiologique, la croissanceBergmann A. et al, 2003. Nous rechercherons si de tels mécanismes sont impliqués dans le développement ou la différenciation du tissu épithélial mammaire et ce par deux approches. D'une part, ces séquences semblant très conservées entre espèces, nous utiliserons les données publiées sur les micro-ARN humains pour réaliser des hybridations sur des ARN de glande mammaire de Souris et de Ruminants à différents stades de développement. Cela devrait nous permettre d'identifier d'éventuels micro-ARN et/ou leurs cibles. D'autre part, des protocoles expérimentaux ont été décrits pour cloner à partir d'ARN totaux les micro-ARN Lagos-Quintana M. et al, 2002. Ces protocoles seront appliqués à des échantillons d'ARN mammaires prélevés à différents stades de développement. Leurs cibles seront alors recherchées à partir de banques d'ADNc en utilisant ces séquences comme sonde.

Ces études pourraient nous permettre de découvrir de nouvelles voies de régulation de la glande mammaire. Ces connaissances seront exploitées tant pour l'obtention d'animaux de phénotypes extrêmes qu'en sélection si un polymorphisme existe dans ces régions.

Mata X., Besnard N., Le Roux K., Tilly G., Andréoletti O., Hudrisier M., Costa Da Silva J., Laude H., Vilotte J.L., 2003, Unexpected high testis-specific transcriptional activity of the Cyclin T1 promoter in transgenic mice. FEBS Letters, 549, 163-166.

Kawasaki H., Taira K., 2002, Identification of genes by hybrid ribozymes that couple cleavage activity with the unwinding activity of an endogenous RNA helicase. EMBO Rep., 3(5), 443-450

Shinagawa T., Ishii S., 2003, Generation of Ski-knockdown mice by expressing a long double-strand RNA from an RNA polymerase II promoter. Genes Dev., 17, 1340-1345.

Zeng Y., Wagner E.J., Cullen B.R., 2002, Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells. Molecular Cell, 9, 1327-1333.

Gottesman S., 2002, Stealth regulation: biological circuits with small RNA switches. Genes Dev., 16, 2829-2842.

Lim L.P., Glasner M.E., Yekta S., Burge C.B., Bartel D.P., 2003, Vertebrate microRNA genes. Science 299, 1540.

Bergmann A., Lane M.E., 2003, Hidden targets of microRNAs for growth control. Trends Biochem. Sci., 28, 461-463.

Lagos-Quintana M., Rauhut R., Yalcin A., Meyer J., Lendeckel W., Tuschl T. , 2002, Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Current Biology, 12, 735-739.