Les banques sont constituées par un ensemble de clones individualisés, ordonnés en microplaques. Chaque clone est défini par son adresse : numéro de microplaque et coordonnée ligne-colonne dans cette microplaque.

La recherche de l'adresse d'un clone ou criblage s'effectue par PCR sur des mélanges de clones ou pools. En effet, Le nombre de clones dans une banque étant très conséquent, il convient d'optimiser le nombre de PCR nécessaires à l'isolement d'un clone. Les clones sont mélangés par groupes de 20 à 24 microplaques de 96 puits qui définissent des Superpools d'ADN. Chaque Superpool est aussi subdivisé en 8 pools de lignes, 12 pools de colonnes et x pools de plaques , x variant de 20 à 24.

Le criblage d'une banque et l'isolement d'un clone s'effectuent en quatre étapes :

1. Une PCR sur de l'ADN génomique pour vérifier les conditions de fonctionnement des amorces

2. Criblage des Superpools

3. Criblage des pools de lignes, plaques et colonnes correspondant au Superpool positif. Le recoupement des trois criblages permet donc d'obtenir l'adresse du clone.

4. Le clone possédant l'adresse obtenue à l'étape précédente est ensuite étalé sur une boite contenant un milieu LB-agar-chloramphenicol et deux colonies individuelles sont à nouveau testées par PCR. Une colonie est choisie et envoyée dans un microtube contenant aussi du milieu LB-agar-chloramphenicol.

Les demandes de criblage doivent être adressées à : Marco MOROLDO (crb-gadie@jouy.inra.fr).

Pour toute demande de criblage, veuillez

1) Indiquer :

- votre nom et votre adresse complète

- le nom du gène

- un descriptif de votre projet d'utilisation des clones en indiquant si vous souhaitez un seul clone ou tous les clones positifs contenus dans la banque. Un seul clone sera expédié dans le cas d'adresses multiples sauf sur demande ou dans le cas de réalisation de contigs (devra être précisé par le demandeur).

- le nom des amorces

- la taille du fragment amplifié

- les conditions de PCR et la température d'hybridation. Pour un nombre de couples d'amorces expédié supérieur à 5, le mieux serait d'envoyer ce type d'information dans un fichier joint (type tableau excel ou word).

- le résultat de l'amplification obtenu sur ADN génomique (photo)

2) Expédier environ 200 µl par amorce (400 µl par couple) à 100 pmoles/µl (100µM)

Ce calcul a été effectué afin de travailler dans des conditions plus confortables. En effet, nous préférons éviter d'avoir à vous redemander d'expédier des amorces en cas de problèmes d'amplification. Si vous disposez d'une concentration plus faible, ajuster le volume afin d'expédier la même quantité. Les amorces doivent être envoyées en solution aqueuse dans des tubes bien fermés et enveloppés dans du parafilm. Les amorces fluorescentes sont utilisables.

Les clones seront expédiés en port dû dans le cas où votre laboratoire est situé en dehors de l'Europe. L'expédition étant réalisée par courrier express FedEx ou DHL, vous pouvez nous donner votre numéro de compte FedEx ou DHL si vous en avez un. Cela facilitera votre gestion. Le délai de réception est d'environ 2 à 3 jours.

Conditions exigées dans le cadre d'éventuelles publications :

- la référence de la banque doit être citée

- l'Atelier Grands Fragments du Département de Génétique Animale de l'INRA doit être cité dans les remerciements

- l'opérateur des criblages peut faire partie des auteurs si la sortie des clones représente une grosse partie du travail publié.

Construction and characterization of a human bacterial artificial chromosome library.
Kim UJ, Birren BW, Slepak T, Mancino V, Boysen C, Kang HL, Simon MI, Shizuya H
Genomics 1996 Jun 1;34(2):213-8

Site de clonage utilisé : HindIII

Sequence du vecteur

• miniprep
• midiprep